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【Apoe小鼠载脂蛋白E高脂APOE小鼠动脉粥样硬化模型】

发布时间:2022-08-15 20:24:59  来源:Apoe小鼠载脂蛋白E高脂APOE小鼠动脉粥样硬化模型价格优  浏览:   【】【】【

Apoe小鼠载脂蛋白E高脂APOE小鼠动脉粥样硬化模型

Apoe小鼠载脂蛋白E高脂APOE小鼠动脉粥样硬化模型基因敲除apoe小鼠构建是利用基因打靶技术产生转基因动物的程序,基因敲除小鼠构建程序一般为(1) 构建基因打靶载体; (2) 将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法) 导入同源的胚胎干细胞中,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将打靶载体中的DNA 序列整合到内源基因组中从而得以表达; (3) 筛选发生同源重组的阳性克隆,通过显微注射或者胚胎凝集的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内制作嵌合体小鼠,在生物活体中研究特定基因的功能。基因敲除小鼠使得研究者们能够观察到某一特定基因完全失活后小鼠表型的改变,从而推断出特定基因的作用。

Apoe小鼠基因敲除apoe小鼠构建基因打靶的原则是, 外源DNA 片段含有与目的基因的某一段核酸序列相同或接近的同源序列, 同源重组就发生在这两个序列之间。基因敲除小鼠外源DNA 序列的定位整合有两种方式, 即插入型(又称O 型) 和置换型(又称8 型)。与此相对应, 基因敲除小鼠构建打靶载体可分为两类: 插入型载体和置换型载体。
同源重组方法(及基因敲除小鼠)
如果研究者想用基因工程载体代替其等位基因,同时又不会对基因组上的其他基因造成任何影响,那么最好的选择就是进行同源重组。要进行这一操作,首先要知道靶基因的DNA序列(如图1)。有了这一信息,用你的目标序列替换任何靶基因就都成为可能。关于同源重组的方法,除本章图解外还有更多的细节,这里只介绍基本的原理。
Apoe小鼠载脂蛋白E高脂APOE小鼠动脉粥样硬化模型基因敲除小鼠构建需要被基因工程载体所替代的靶基因图谱。编码序列由方框标出,其上下游侧翼DNA序列也被标明。由靶基因向两侧延伸的箭头代表染色体上其他的连续DNA序列。

基因敲除小鼠构建接下来的步骤就是设计并构建DNA载体,用以插入并替代染色体上的等位基因。这一载体可以包含你所选择的任何DNA序列,用来将不同的等位基因,即研究者所要插入的目标序列(编码区或非编码区均可)或报告基因(例如:抗生素抗性基因或绿色荧光蛋白)插入基因组中。但不论插入哪种序列,都需要包含一些与靶基因上下游侧翼序列一致的DNA序列(如图2).除了阳性筛选标记(例如抗生素抗性基因),通常还需要在载体中加入阴性筛选标记(例如胸苷激酶,tk)。通常阴性标记位于载体上与靶基因同源的序列之外。
基因敲除小鼠构建用于同源重组的基因工程载体图谱。取代序列的上下游侧翼序列与靶基因的上下游侧翼序列一致。阴性筛选标记tk位于载体上与靶基因同源的序列下游。

基因敲除小鼠构建基因工程载体被加入到包含靶基因的细胞中。其替代等位基因的机理还不完全清楚,但是与细胞减数分裂和有丝分裂中同源染色体在细胞板处联会非常相似,基因工程载体能够找到靶基因并在与之相同的DNA序列处发生同源重组(如图3)。这种重组可能发生在二者相同侧翼序列的任何位置,但具体位置则由细胞本身决定,而不是人工能够控制的。
基因敲除小鼠构建同源重组发生前的载体与靶基因。令人惊奇的是,载体自身能够进入细胞核并与靶基因并排排列。这种排列的机制尚不清楚,但是在某些物种中,这种排列的确比其他物种中的更完美,酵母就是其中之一。小鼠是用于同源重组的较好的哺乳动物系统,但是其中重组发生的效率不如人类细胞高。
细胞发生同源重组后,新的DNA片段即目标序列被插入了基因组中。其中只是靶基因及其上下游的一些侧翼序列被载体中同源的部分所取代,基因组的其他部分并不受到影响(如图4)。在载体与靶基因发生重组后,最初的靶基因序列被交换到了载体上。由于载体不能够在细胞核中独立地进行复制,因此随着细胞的分裂很快就丢失了。而被替代后的基因组则忠实地进行自我复制,此时新插入的目标序列也就得以复制了。
发生了同源重组的细胞(带有阳性筛选标记)可以用加入了特定抗生素的培养基筛选出来。需要注意的是,阴性筛选标记并没有通过同源重组整合到染色体中。

基因敲除小鼠构建同源重组发生后的产物。此时染色体上的靶基因被载体携带的目标序列所取代,同时还包括一些与载体一致的侧翼序列。而靶基因则被交换到载体上,随着细胞的分裂而丢失。自此,插入到基因组中的目标序列就会像其他所有序列一样,随着基因组的复制而被忠实地复制。
如果载体与基因组上的非同源区域并排排列,就可能发生任意的非同源重组,此时载体上携带的阴性选择标记就会被整合到基因组中(如图5)。

非同源重组发生前的载体与靶基因。此时发生的重组是任意的。需要注意的是,在这种情况下,阴性筛选标记被整合到了基因组中。
发生了非同源重组的细胞(如图6)在阳性筛选标记的特定抗性培养基中能够存活。但是,有一种药物叫做更昔韦洛(gancyclovir),能够杀死任何携带有tk基因的细胞。因此,发生了同源重组的细胞就可以在抗生素与更昔韦洛同时存在的培养基中存活,而发生了非同源重组的细胞则会被更昔韦洛杀死。
非同源重组发生后的产物。阳性和阴性筛选标记同时进入细胞染色体,因此更昔韦洛能够杀死发生了非同源重组的细胞。

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责任编辑:Apoe小鼠载脂蛋白E高脂APOE小鼠动脉粥样硬化模型价格优
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