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合成培养基(液)基本成分有哪些?

合成培养基的种类虽多,但一般均含有氨基酸、维生素、糖类、无机离子和一些其它的辅助性成分。

(1)氨基酸:是合成培养基的主要成分,合成培养基中以必需氨基酸为主。不同种类的细胞对氨基酸的要求也不同,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。

(2)维生素:细胞生长代谢中大多数的酶、辅酶是依靠维生素来形成的。在细胞培养中,尽管血清是维生素重要来源, 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。

(3)糖类:培养基中的碳水化合物包括葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠等,主要提供细胞生长的能量,也可参与合成蛋白质和核酸。

(4)无机离子:培养基含有平衡盐溶液的钾、钠等无机盐,有些培养基含有微量元素,如Fe2+、Zn2+、Ca2+等。

(5)其它成分:有时可在少数合成培养基中加入代谢的中间产物、氧化还原剂、三磷酸腺苷、辅酶A等。为适应某些特殊培养的需要可以补加一些新的成分,如杂交瘤技术中常用的DMEM培养液,使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇。

平衡盐溶液

平衡盐溶液(BSS)是组织细胞培养中常用的基本液体。它可以维持渗透压、调节pH值及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。主要作为合成培养基(液)的基础液及用于洗涤组织、细胞等。常用的平衡盐溶液有PBS、Hanks液(HBSS)与D-Hanks液等。各种平衡盐溶液的主要区别在于氯化钠的浓度、离子的浓度及缓冲系统不同,可根据需要选用适当的平衡盐溶液。

消化液

原代培养中欲分散组织、细胞时,传代中欲使细胞脱离附着的底物时均需使用消化液。组织细胞培养中常用的消化液为胰蛋白酶、EDTA两种溶液,使用时可以单独使用或混合使用。

胰蛋白酶是从动物胰脏分离的一种水解酶,其主要功能为使细胞间的蛋白质水解、细胞分散。胰蛋白酶分离细胞的能力与细胞种类及细胞的特性有关,不同种类的细胞以及不同数量的细胞采用胰蛋白酶消化的时间亦不相同。浓度大、温度高、新配制的胰蛋白酶可使细胞分离速度增快。胰蛋白酶溶液在pH8.0,温度为37℃时,作用能力最强。

注意:钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰蛋白酶活力。消化细胞时,加入一些血清或含血清的培养液,或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。

保存条件:配制好的胰蛋白酶溶液必须保存在-20℃冰箱中,以免分解失效。

请在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液

EDTA是一种化学螯合剂,主要作用为能螯合Ca2+、Mg2+,使细胞分离,对细胞毒性小。常用的浓度为0.02%。

胰蛋白酶和EDTA联合使用可提高消化效率,但需注意EDTA不能被血清中和,使用EDTA处理细胞后,一定要用Hanks液冲洗干净,因残留的EDTA会影响细胞生长。

液体培养基怎么保存?

(1)液体培养基应于4℃冰箱避光保存,实验前需放入37℃预热再用。

(2)未加血清液体培养基存放期为12个月,加入血清的液体培养及存放期为6个月。

(3)液体培养基中的L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。如果细胞生长不良,可以再添加适量L-谷氨酰胺。

液体培养基偶然被冻,可否继续使用?

如果细胞培养基偶然被冻,您应该融化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生,培养基可以正常使用,如果出现沉淀,只能丢弃这些培养基。

培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗?

大部分添加物和试剂最多可以冻融3次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。

为什么有的培养基中要去掉酚红?

酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂,桃红色表示中性pH,黄色代表酸性pH,紫色表示碱性pH。但是酚红具有一定的固醇类激素样的作用,如雌激素样作用,尤其对于所培养的哺乳类动物细胞,可能发生的固醇类反应不可忽视。为了避免酚红干扰检测结果,许多研究人员视情况不同来选择是否使用含酚红的培养基。

培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

细胞通常以葡萄糖作为碳源,丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。如果没有足够的葡萄糖供应,细胞就会选择丙酮酸钠作为代谢底物。

在培养基中加入HEPES有何好处?

培养基中最常用的缓冲体系是碳酸氢盐,它可提供营养,但却在生理pH条件下会降低缓冲能力。而HEPES是一种很强的缓冲剂,能使细胞培养基在pH7.2-7.6条件下缓冲能力增强。

有关血清的常见问题

血清是细胞培养中最重要的元素之一。

(1)保存血清最好的方法?

建议血清应保存在-5℃至-20℃。需要长期保存的血清必须储存于-20℃至–70℃低温冰箱中。然而,若存放于4℃时,请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶,建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。由于血清结冰时体积会增加约10%,因此,血清在冻入低温冰箱前,必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

(2)如何解冻血清才不会使产品质量受损?

建议采用逐步解冻法:将-20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清取出后先置于2℃-8℃冰箱中使之融解,然后移入室温待全部溶解后再分装。在溶解过程中需轻轻规则地摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

(3)血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理?

血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成的,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。

若您欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞您的过滤膜。

(4)何谓热灭活?

一般是以56℃, 30分钟来处理已解冻的血清,因为此加热步骤可以使补体去活化,而补体所参与的反应有:溶细胞活性,平滑肌的收缩,肥大细胞和血小板组胺的释放,增强吞噬作用,淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

(5)有必要做热灭活吗?

实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误认为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此建议,若非必须,可以不需要做热处理这一步。如此一来,不但节省宝贵的时间,更确保血清的质量!

(6)如何避免沉淀物的产生?

在使用血清的时候,注意下列的操作:

①解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),非常容易产生沉淀物。

②解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。

③请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。

④血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。

⑤若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。

预祝你的实验顺顺利利!


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