骨髓间充质干细胞BMSCs培养/诱导分化/成骨成脂诱导生物医学科研课题整体项目实验外包实验代做公司平台
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骨髓间充质干细胞（BMSCs）
实验动物
4 周龄SD大鼠
主要试剂及仪器
DMEM/ F12培养基、胎牛血清和胰酶均购自美国Gibico 公司，CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司。
生物医学科研课题整体项目实验外包实验代做步骤
a． 取SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
b． 酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨,剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍。
c． 从中折断骨头，用2ml无菌注射器吸取PBS溶液冲出骨髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清。
d． 用含10%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12 重悬细胞，接种于无菌培养瓶，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。
e． 24小时后弃去培养液，PBS冲洗 2~ 3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每2~ 3d换液1次，7~ 10d细胞生长融合，经0.25%胰酶消化，1~2传代，其后一般3d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。
生物医学科研课题整体项目实验外包实验代做鉴定
胰酶消化P3代细胞，PBS洗涤2次，分别加入PE标记CD29、CD34、CD45、CD90单克隆荧光抗体，并设同型对照，室温避光孵育，应用流式细胞仪检测BMSCs的表面标志。
生物医学科研课题整体项目实验外包实验代做细胞形态
BMSCs原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长,细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显,出现以梭形为主的多种形态，10~14天70% ~80 %可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细胞融合时呈漩涡状和状排列。
骨髓间充质干细胞诱导分化实验外包实验代做公司平台
（1）收集细胞：在显微镜下观察培养瓶贴壁面至70%-80%融合，在超净工作台上操作，先吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗2~3次，50mL培养瓶加入胰酶消化液约1-3mL，按此比例进行消化，晃动使消化液铺均匀，置37度培养箱约2-5min，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3mL完全培养基后，轻轻吹打，收集细胞至离心管，1 000 rpm离心5 min弃上清，加培养液，轻轻吹打成细胞悬液。
（2）细胞接种：将上述细胞悬液接种于无菌的6孔细胞培养板，加入2mL完全培养基，放入CO2培养箱 37℃培养 。
（3）细胞诱导：待细胞至50%-60%融合时，加入含50ug/lVEGF、10ug/lFGF、10%FBS的诱导培养液，放入CO2培养箱 37℃培养，连续诱导培养21d,每隔2天换液，每周传代1次。
生物医学科研课题整体项目实验外包实验代做血管形成实验
(1) 将Matrigel放于4℃融化（不能放于室温，凝固之 后不可以再用）。灭菌的100μL枪头，24孔板冷藏备用；
(2) 开始实验时，从冰箱中取出冷藏的枪头和24孔板，在24孔板每个孔中加入150μL Matrigel。加入胶时注意保持枪头垂直于孔中间位置，Matrigel一直保持放在冰上；
(3) 加入胶后，将整个培养板放入培养箱中，放置30min使凝胶凝固；
(4) 取经不同浓度药物A处理的不同代次的主动脉内皮细胞，消化后用无血清的培养基调整细胞浓度到2×105 cell/mL；
(5) 从培养箱中取出24孔板，每孔加入200μL细胞悬液；
(6) 盖上盖子后放入培养箱培养；
(7) 24h内记录细胞变化
生物医学科研课题整体项目实验外包实验代做人间充质干细胞hMSC成骨诱导
待细胞长至基本融合后，制备完成的成骨诱导培养液（基础培养液+0.1μmol/L+ 50μg/mL抗坏血酸+ 10 mmol/L β - 甘油酸钠），每隔一天换液一次，诱导21天后再进行矿化结节的茜素红染色。
茜素红染色：
1、诱导后细胞爬片用PBS漂洗2x2min；
2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；
3、PBS漂洗，3x2min；
4、茜素红染液染30min；
5、双蒸水冲洗2次；
6、干燥，封片。
3T3-L1脂肪细胞诱导分化成脂肪细胞
3T3-L1细胞融合至约70%时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代至6孔培养板中，待细胞接触抑制2d后(诱导分化第0d) ，用经典鸡尾酒诱导方案诱导前脂肪细胞分化，加入分化诱导培养基1（0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L DEX、10ug/mL INS），72h后撤去IBMX和DEX，完全培养基中仅含有INS（诱导培养2），继续培养3d后，仅含有10% FBS，2d换液1次，诱导分化8~10d。
生物医学科研课题整体项目实验外包实验代做注意事项：
1) 待细胞接触抑制后2d加入诱导剂。太早，细胞没有退出生长周期。太迟，细胞诱导后容易漂浮。
2) 3T3细胞株20代以后分化困难，最好挑选5代左右开始诱导分化。将细胞冻存起来，使用时再复苏。
3) 大约需要8~10天，可以诱导分化成功。之后换液处理需要轻缓，以免损失细胞。
生物医学科研课题整体项目实验外包实验代做细胞细胞形态学观察
倒置显微镜下观察分化前3T3-L1前脂肪细胞呈梭形，胞浆内无脂滴，分化后3T3-L1前脂细胞呈圆形，胞浆内含有大量的脂滴。
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